lunes, 11 de junio de 2012

UNIDAD 10


SEP                   SNEST               DGEST


“INSTITUTO TECNOLOGICO
DE CIUDAD ALTAMIRANO”
 

PRESENTA: MARTIN HERRERA JUAREZ
UNIDAD “10”
“TECNICAS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR”
No DE CONTROL: 09930312
CARRERA: LIC. EN BIOLOGIA
VI SEMESTRE

Ciudad Altamirano gro. México a 11 de JUNIO del 2012

TEMARIO
UNIDAD
TEMAS
SUBTEMAS
10
Técnicas de la biología molecular
10.1 Métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos.
10.2 Técnicas de hibridación.
10.3 Técnicas de clonación de genes.
10.4 Prueba de PCR en el diagnostico de enfermedades
10.5 Genéticas
10.6 Por microorganismos (bacterianas, protozoarios, entre otros)
10.7 Tecnología del ADN recombinante.



INTRODUCCIÓN

TECNICAS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR: son  todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que significa: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.
Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, Hepatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, etc.



OBJETIVOS

  • ·         Conocer y aplicar las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, medico y ecológico.


METODOLOGÍA

La metodología que utilizare o los pasos a seguir para la publicación y desarrollo de los diferentes subtemas de esta unidad serán: haciendo un resumen al final de la unidad de todos los subtemas, publicando lo más importante y con toda claridad, de cada tema visto en clase. Además los trabajos que se hagan  en clase se publicaran en ese mismo día y las evaluaciones (exámenes) se publicaran al  final de la unidad, así como las tareas que deje el profesor en la fecha que indique y como las indique.

BOBLIOGRAFIA



miércoles, 6 de junio de 2012

TAREA DE LA UNIDAD 9


LAS BACTERIAS DE DIFERENTES ESPECIES PUEDEN COMPARTIR PLASMIDOS POR TRANSFORMACIÓN?

Si. Aunque lo mas común es que se de entre bacterias de las mismas especies. La transformación es la transferencia genética que resulta de la incorporación de DNA desnudo por una célula receptora desde una célula donadora. Ciertas bacterias (ej. Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus) son capaces de tomar DNA del medio ambiente y ese DNA que es introducido puede llegar a ser incorporado al cromosoma de la célula bacteriana receptora. Esto se llama transformación natural. Porqué si puede ser transferido ADN entre bacterias de especies diferentes?. Porqué lo que se requiere para que se lleve correctamente la transferencia por transformación es que exista homología entre el ADN de la bacteria donante y el ADN  de la bacteria receptora, esto para que se pueda llevar la recombinación adecuadamente. Es decir, cualquier porción del genoma de la célula donante puede incorporarse, siempre y cuando sea igual o similar a la de la célula receptora. El DNA de la célula donante para que pueda ser incorporado al cromosoma de la célula receptora y no tenga ningún problema para ser incorporado debe tener las siguientes características: debe ser de doble hélice, similar al DNA de la célula receptora, por que el ADN  de la bacteria donadora que entra a la bacteria receptora, se pega en la región que exista mayor homología entre las bases, esto para que se lleve acabo la recombinación del ADN, debe tener bajo peso molecular y  tamaño pequeño. Con estas características la bacteria que las presente, puede ser donadora para otras, sin necesidad de pertenecer a la misma especie. Pueden ser de diferentes especies o cercanas. Con estas recombinaciones se ha logrado que numerosas bacterias sean inmunes a diferentes antibióticos y como consecuencia se hacen más fuertes y logran transmitir esas características a sus descendientes, cuando se dividen.

Existen varios géneros con especies que poseen sistemas naturales de transformación:

Entre las bacterias Gram positivas los ejemplos más estudiados son los de:
Descripción: bullet
Streptococcus
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Bacillus

 
Entre las bacterias Gram negativas:
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Haemophilus
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Neisseria
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Moraxella
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Acinetobacter
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Azotobacter
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Pseudomonas
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Cianobacterias del gén. Synechococcus


 



Pero también se puede llevar acabo la transferencia del ADN de forma artificial. Esto con la intervención del humano, llevando acabo diferentes técnicas para hacer mejoramientos de organismos, utilizando diferentes especies y entre diferentes especies. recombinando el ADN de los organismos. También por que muchas especies de bacterias carecen de sistemas naturales de transformación.
En los últimos años se ha logrado desarrollar sistemas artificiales para producir “células competentes” en algunas de ellas (como Escherichia coliSalmonella typhimurium  y algunas especies de Pseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los estudios genéticos, especialmente mediante manipulaciones in vitro: por ejemplo, la transformación artificial de E. coli con ADN plasmídico es una de los métodos básicos de la Ingeniería Genética.


La obtención de células competentes en E. coli consiste en ir concentrando un cultivo recogido en fase logarítmica, mediante lavados sucesivos en una solución fría (4ºC) de Cl2Ca, tras lo cual la mezcla de células y ADN se someten a unos 2 min. a 42ºC (choque por calor). Este tratamiento altera las envueltas (sobre todo la membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN. Los plásmidos (pueden de especies similares o diferentes) entran a la célula como moléculas de cadena doble intactas, mientras que los ADN lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas citoplásmicas (RecBCD). Los transformantes se suelen seleccionar en base a la resistencia a algún o algunos antibióticos conferidos por los plásmidos artificiales usados en Ingeniería Genética.


BIBLIOGRAFIA

TAREA DE LA UNIDAD 8



CONTROL GENETICO DEL GEN BRCA


GEN BRCA2:

En 1994, los científicos descubrieron otro gen (similar al BRCA1) al que denominaron BRCA2.Pertenece a la familia de los genes supresores de tumores, que en el organismo sano controlan la proliferación celular. Ellos, por tanto son reguladores negativos de crecimiento y cuando no están presentes en la célula o se encuentran inactivos a causa de mutaciones, las células dejan de crecer normalmente y adquieren propiedades proliferativas anormales, características de las células tumorales. Estos genes que son ubicuos, porque se expresan en todas las células del organismo y participan en la reparación del ADN.Los estudios del gen BRCA2 han puesto en evidencia que es el responsable del 35% de los cánceres de mama hereditarios en mujeres y de un 14% del cáncer de mama en varones. Se han descrito unas 450 mutaciones.


Las mutaciones de BRCA2 se hallan asociadas a un riesgo incrementado para el desarrollo de diversos cánceres, como el de mama femenino y masculino, el de ovario, de próstata, de páncreas y de laringe. BRCA2 se halla ubicado en el brazo largo del cromosoma 13 (13q 12-13). Al igual que BRCA1, el producto génico de BRCA2 está involucrado en el proceso de reparación del ADN, formando un complejo multiproteico con otras proteínas como la Rad. 51, BARD1 y BRCA1.



Cuando una persona tiene una copia alterada o mutada del gen BRCA2, aumenta su riesgo de sufrir los diversos tipos de cánceres:

mutación del gen BRCA2
·     del 59 por ciento al 82 por ciento de riesgo de por vida de cáncer del seno (en las mujeres)
·     seis por ciento de riesgo de por vida de cáncer del seno (en los hombres)
·     hasta un 27 por ciento de riesgo de por vida de cáncer de ovario
·     mayor riesgo de otros tipos de cánceres, como cáncer de páncreas, de próstata, de laringe, de estómago y melanoma.

La mayoría de las personas que presenta una mutación en el gen BRCA1 o BRCA2 tiene una mutación única: una que es específica para ellos y para su familia. Hasta el presente, se han identificado cientos de mutaciones únicas en ambos genes BRCA1 y BRCA2. No obstante, existen unas pocas excepciones. Por ejemplo, en individuos de ascendencia judía ashkenazita y personas provenientes de los Países Bajos, Islandia y Suecia se encontraron mutaciones específicas recurrentes. Las mutaciones vuelven a aparecer en estos grupos a causa del efecto del fundador. “Fundadores” son un pequeño grupo de personas que, debido a un aislamiento geográfico o religioso, se reproducen entre sí. Cuando un pequeño grupo de personas se reproduce entre sí a través de las generaciones, pueden recurrir mutaciones específicas poco comunes y volverse más frecuentes en la población. Se llama efecto del fundador.La población judía ashkenazita actual surgió de un pequeño grupo de fundadores, uno o más de los cuales debe haber portado mutaciones específicas en los genes BRCA1 y BRCA2. En especial, existen tres mutaciones (dos en el gen BRCA1 y una en el BRCA2) que representan la mayoría de las mutaciones de BRCA vistas en las personas de ascendencia judía ashkenazita. Cuando se trata de pruebas genéticas esta información tiene un significado práctico ya que algunos laboratorios ahora ofrecen paneles de mutación “étnico-específicos”. En algunos casos, en lugar de investigar el gen entero cada vez que se realiza una prueba a una persona, los laboratorios pueden buscar primero mutaciones específicas basadas en el origen étnico de la persona. Además, el efecto del fundador es importante en los individuos judíos ashkenazitas porque ha llevado a una mayor incidencia de mutaciones BRCA en esta población. En la población en general, se estima que uno de cada 800 individuos presenta una mutación en los genes BRCA1 o BRCA2. Por el contrario, uno de cada 40 individuos de origen ashkenazita presenta una de las mutaciones recurrentes. Esta mayor incidencia tiene consecuencias en cuanto a la evaluación de la trascendencia de antecedentes familiares de cáncer del seno y de ovario en personas de origen ashkenazita versus personas que no son de origen ashkenazita.


Una investigación llevada a cabo en Memphis (Estados Unidos) propone que ciertos genes previenen el cáncer y también guían el desarrollo normal del sistema nervioso antes del nacimiento y durante la infancia mediante la reparación del ADN dañado. Se ha demostrado que el gen Brca2 desempeña un doble papel en el desarrollo del sistema nervioso: elimina los errores que se producen en el ADN debido a la formación de nuevas copias de cromosomas y evita la formación de los meduloblastomas. Los meduloblastomas son un tipo de cáncer de cerebelo que constituye el 20% de los tumores cerebrales de la infancia; más de la mitad aparecen en niños menores de 6 años. El gen Brca2 es importante porque como el cerebelo crece en tamaño y complejidad antes y después del nacimiento, se produce una rápida formación de nuevas células nerviosas. Este estudio muestra que el gen actúa como un mecanismo que permite la reparación del ADN dañado cuando las células duplican sus cromosomas cada vez que se dividen. La enorme tasa de divisiones celulares durante el crecimiento del cerebelo incrementa considerablemente el riesgo de daño del ADN. Por tanto, debe existir alguna vía que permita asegurar que este daño se repara rápidamente para prevenir la acumulación anormal de células. Cuando los investigadores eliminan Brca2 durante el desarrollo del sistema nervioso en ratones, la pérdida de este gen conduce a apoptosis, disparando la incapacidad de las células de reparar el ADN dañado. Esto reduce el tamaño del cerebelo, produciendo malformaciones en la forma del cerebro e impidiendo el movimiento de ciertas células nerviosas que normalmente migran a través del cerebelo durante el desarrollo.




BIBLIOGRAFIA


lunes, 4 de junio de 2012

CONCLUSIONES


Como conclusiones de esta unidad podemos decir que se aprendieron las diferentes formas de la transferencia del material genético entre bacterias, como; la transformación, que es cuando una bacteria agarra fragmentos de ADN desnudo de otra bacteria del medio donde se encuentra y lo hace suyo, es decir, lo hace parte de su cromosoma por recombinación. Y el ADN es de cadena doble y cuando entra al interior de la bacteria receptora una cadena se degrada y solo una logra unirse al cromosoma de la bacteria. Otra es la transducción, que es cuando una bacteria donadora le transfiere su material genético a otra bacteria llamada receptora por medio de un bacteriófago, este lleva en su capside el ADN procedente de la bacteria donadora hacia la bacteria receptora, y a esta el bacteriófago inyecta el ADN que trae de la bacteria donadora y así se da el proceso de transducción. Otra es la conjugación, aquí la transferencia del material genético se da entre dos bacterias por contacto físico, una llamada donadora y otra receptora, donde una se llama f+ y la otra f-, la f+ le transfiere el material genético a la f- por medio de un Pili o puente de conjugación, son fragmentos de ADN que le transfiere y las bacterias que poseen esta capacidad son especiales, por que no todas poseen la capacidad de transferir su material genético a otra bacteria y no se pueden intercambiar el ADN entre las f+ solo a las f-. ya una ves transferido el material genético, la f- se convierte en f+ y ahora ya puede también a transferir material genético a otras bacterias f-. Todas estas formas de transferencia son de forma natural, pero también se pueden hacer de forma artificial, utilizando diferentes técnicas como; la micro inyección, la electroporacion, la biobalistica o pistola de genes, estas son de forma físicas, también existen las de forma químicas que son las mas utilizadas; el método del fosfato cálcico, el método de liposomas, el método del DEAE dextrano, el método de ADN desnudo. Estas técnicas artificiales se pueden usar tanto para las bacterias como para los organismos eucarioticos, en estos últimos las utilizan más para hacer organismos transgénicos.

BIBLIOGRAFIA

domingo, 3 de junio de 2012

9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL


9.2.1 FÍSICOS

MICROINYECCION
La micro inyección es un proceso que consiste en utilizar micro agujas para insertar sustancias a un nivel microscópico o en el límite de lo macroscópico dentro de una célula viva. Es un simple proceso mecánico en el cual una aguja extremadamente fina penetra la membrana celular y a veces la membrana nuclear para lanzar su contenido. La micro inyección es normalmente realizada bajo un microscopio óptico llamado micro manipulador. El proceso es frecuentemente usado como un vector en ingeniería genética y transgenética para insertar material genético en una célula. El proceso de clonación también involucra micro inyecciones.
Las micro agujas miden alrededor de 10 micrómetros. Pueden contener cerca de 15 micro litros de ADN. Es similar a la sección transversal de un cabello humano. Es un método muy preciso de transferencia génica. Requiere personal capacitado.
Los científicos pueden crear simples organismos transgénicos inyectando genes dentro de los testículos de nematodos en el punto en que las células que se convertirán en su esperma están bajo el proceso de meiosis.
La micro inyección es usada como un vector en la producción de plantas transgénicas.
La micro inyección de genes dentro de óvulos fertilizados es un vector comúnmente utilizado en la producción de animales transgénicos.



ELECTROPORACION:
La electroporación o electro permeabilización es un significativo aumento de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causado por un campo eléctrico aplicado externamente. Es habitual en biología molecular como forma de introducción de diferentes sustancias en células, como por ejemplo sondas moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido.
Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición excesiva de células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o necrosis, procesos que provocan la muerte celular.
En biología molecular, el proceso de electroporación es usado habitualmente para la transformación de bacterias, levaduras y protoplastos vegetales. Además de membranas lipídicas, las bacterias también tienen una pared celular compuestas de peptidoglicano y sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por naturaleza y sólo actúan como corazas que protegen a la célula de impactos ambientales severos. Si bacterias y plásmidos se mezclan los plásmidos pueden transferirse al interior de las células tras la electroporación. En este proceso suelen emplearse varios cientos de voltios, que atraviesan una distancia de varios milímetros. A continuación, las células han de ser manipuladas cuidadosamente hasta que tienen la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que contendrán copias del plásmido. Este proceso es aproximadamente diez veces más efectivo que la transformación por métodos químicos.
Este procedimiento es también altamente eficiente para la introducción de genes externos en células en cultivo, especialmente en las de mamífero. Por ejemplo, se usa en el proceso de producción de ratones knockout, así como en el tratamiento de tumores, terapia génica y terapias basadas en células. El proceso de introducir ácidos nucleicos externos en células eucariotas se conoce comotransfección.


BIOBALISTICA:
El término biobalística deriva de la conjunción de “biología y balística” o “balística biológica”. Este es un método muy original ideado y refinado en la década de 1980 por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de célula. En este procedimiento el ADN es introducido en las células por medio de partículas microscópicas (macropartículas) aceleradas a velocidades supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. Las partículas son aproximadamente esféricas (de 0.4 a 2.0 micrómetros de diámetro), están hechas de materiales densos como oro o tungsteno (ver microfotografía 1 y 2, respectivamente), y se recubren con el ADN que se desea transferir a las plantas. Para que las macropartículas pueda atravesar las membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, son impulsadas a gran velocidad por explosión de pólvora seca, liberación de gas comprimido a alta presión (aire, helio, CO2 o N2), o por una descarga eléctrica de una gota de agua. Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de las macropartículas debido a las modificaciones del entorno iónico.
Si las partículas atraviesan las membranas y son atrapadas en el núcleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinación al azar, lo que se considera como transformación estable. La transformación estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de selección in vitro (ver cuadernos Nº 5, 18 y 67) que permita distinguir células transformadas y no transformadas.
En este método de transformación las construcciones genéticas son más simples e incluyen los genes de interés y de selección con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plásmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las células, o bien de forma de molécula lineal (el plásmido cortado en un punto), a diferencia de los plásmidos utilizados con Agrobacterium (plásmido ti desarmado). También es muy común que una vez obtenida la construcción genética dentro de un plásmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para sólo tener la secuencia con los genes de interés y de selección (incluidas las secuencias regulatorias) y así reducir el fragmento de ADN a transferir.



9.2.2 QUÍMICOS

MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.
Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de  fosfatos. En esta situación coprecipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.


MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO.
Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano  o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transigentes.


MÉTODO DE LIPOSOMAS.
Se basa en la formación de complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas del método son, aparte del elevado precio de los lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación entre lípido y DNA (relación de cargas), la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se exponen las células al complejo y la presencia o ausencia de suero.  


BIBLIOGRAFIA