SEP
SNEST
DGEST
"INSTITUTO
DE CIUDAD ALTAMIRANO”
PRACTICA: EXTRACCION Y SEPARACION DE ADN
PRESENTA: MARTIN HERRERA JUAREZ
No DE CONTROL: 09930312
CARRERA: LIC. EN BIOLOGIA
VI SEMESTRE
Ciudad Altamirano gro. México a 26 de marzo del 2012
RESUMEN
La
extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene
que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al
núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear
para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como lava vajillas emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las
rompen. La sal evita la unión de las proteínas al ADN. Para aislar el ADN hay
que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se
encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol
y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros
componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.
SUMMARY
DNA extraction requires a series of basic steps: First you have tobreak the cell wall and the plasma membrane to access the cell nucleus. Then you must also break the nuclear membrane to freeDNA. The soaps used as emulsifiers dishwasher lipids of cell membranes and break. The salt prevents the binding of proteins to DNA. To isolate the DNA needs to be done to precipitate in alcohol.DNA is soluble in water but when alcohol is unwound and precipitates in the interface between alcohol and water. In addition to allowing us to see the DNA, the alcohol separates the DNA from other cellular components, which are left in the aqueous solution.
INDICE
v ANTECEDENTES_________________________________________1
v DEFINICION
DEL PROBLEMA_______________________________2
v JUSTIFICACION___________________________________________3
v OBJETIVOS_______________________________________________4
v FUNDAMENTO
TEORICO___________________________________5
v MATERIALES
Y METODOS__________________________________6
v RESULTADOS____________________________________________7
v CONCLUCIONES__________________________________________8
v RECOMENDACIONES______________________________________9
v FUENTES
CONSULTADAS__________________________________10
ANTECEDENTES
La extracción
y separación del ADN, no es muy conocido el método que se utiliza o la forma en
como se extrae y se separa el ADN ya sea vegetal o animal para su estudio. Solo
conocen la forma de hacerlo la gente que esta preparada como los químicos o biólogos,
ya que estos tienen los conocimientos necesarios para poder hacerlo
correctamente. La extracción y separación del ADN es importante ya que gracias
a esto uno puede estudiar el ADN ya sea vegetal o animal para saber ciertas características
que se desean conocer como por ejemplo; para conocer si una persona esta
enferma o algo común que hacen los doctores antes de intervenir a un paciente
en quirófano es hacerle un estudio de sangre para ver si anda bien en el numero
de plaquetas y así poder determinar si lo interviene o no, entre otras cosas
mas se puede utilizar esta técnica.
Los motivos
para la realización de este trabajo es que la gente que no esta preparada para
hacer este tipo de estudios solo conozcan como
es el procedimiento y todo lo que implica realizarlo, además de que
tengan conocimiento de cual es el principal objetivo de hacer estas técnicas, además
de saber como uno puede separar diferentes moléculas como, proteínas, lípidos,
carbohidratos y por supuesto ADN, para los estudios que se quieran hacer. Y si
les interesa meterse mas a fondo sobre este tema puedan estudiar incluso una
carrera que estudie todo lo relacionado con el ADN o con la vida como; la
medicina o la biología, entre otras carreras similares.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Se puede
extraer ADN vegetal o animal?
Conque
objetivo se extrae el ADN?
Cualquier
persona puede realizar esta técnica?
El ADN
tanto vegetal como animal se puede extraer y separar para un mejor estudio y
las personas que hacen esto son personas altamente capacitadas, es decir, que
tienen los suficientes conocimientos para llevarlo acabo correctamente. Ya que
requiere de una serie de pasos y un laboratorio químico que tenga las
suficientes sustancias que se requieren y los aparatos necesarios.
JUSTIFICACIÓN
Este
presente trabajo tiene gran relevancia ya que es de gran interés para toda la
sociedad en general, ya que a todos nos interesa saber mas sobre el estudio de
la vida ya que entre uno sepa mas sobre
esto va a poder saber muchas cosas que antes no se sabían y mas si es para
salvar su vida, todos sabemos que el ADN es donde se guarda todo el material genético
que es trasmitido de una generación a otra y que esto ha permitido salvar a
muchas especies y hacerlas mas fuertes. Y una forma mas fácil de poder estudiar
el ADN es extrayéndolo y separándolo ya sea de tejidos animales o vegetales
para el estudio que se desee alcanzar,
por esto y otras razones es importante este trabajo para conocer mas a fondo
sobre como se puede extraer y separar el ADN y con que fines se hace, además este
trabajo lo puede ver cualquier persona ya que no se necesita de dinero para
poder obtener esta información solo de interés y entusiasmo por conocer mas
sobre uno mismo.
OBJETIVO
- Extraer DNA Y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.
FUNDAMENTO
El proceso de extracción del DNA geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son
muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas
en la estructura de estos dos tipos de macromoléculas.
El primer paso en la purificación del DNA consiste
en homogeneizar las
células y distar los núcleos de
los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de
ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar
los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la
solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la
preparación.
El objetivo de los pasos de
purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y
proteínas.
La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interface. La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se aísla de las demás moléculas conforme sale de la solución.
En la interface el RNA sale de la solución salina.
En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa.
Enseguida sale la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.
La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación.
Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a sus cargas.
Los fragmentos de DNA lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras.
Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases.
Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los fragmentos está la concentración de agarosa.
La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interface. La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se aísla de las demás moléculas conforme sale de la solución.
En la interface el RNA sale de la solución salina.
En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa.
Enseguida sale la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.
La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación.
Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a sus cargas.
Los fragmentos de DNA lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras.
Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases.
Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los fragmentos está la concentración de agarosa.
MATERIALES Y METODOS
Para
realizar esta práctica se necesito de 2 horas en laboratorio para poder
preparar el tejido que se iba a utilizar para poder extraer el ADN y poder
separarlo. Además esta practica se izo en equipo para que fuera mas rápido mientras
unos preparaban una cosa los otros empezaban con otras, por ejemplo unos
machacaban bien el tejido a utilizar(hígado de pollo) y otros iban preparando
la solución que se iba a utilizar una vez ya bien machacado el tejido, y así
fuimos realizando toda la practica. Para realizar correctamente la práctica nos
fue supervisando el profesor de biología molecular además de que nos íbamos guiando
por un documento donde venían todos los pasos a seguir proporcionado por dicho
profesor. Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes:
v Tubos de centrifuga 1 ml
v Tubos de ensayo de 5 ml
v Centrifuga
v Micropipetas de 1000 y 200ul
v Agua destilada estéril (20ml para todos)
v Etanol al 100 % frio (20ml es suficiente)
v NaCL 3M
v Buffer de extracción de ADN ( urea, NaCL, EDTA, 20ml es suficiente para todos)
v Fenol frio (20ml es suficiente, manejase con guantes)
v Mortero y pistilo
v Hígado y sangre
v Papel aluminio
v Cleenpack
v guantes
El
procedimiento fue el siguiente:
A. Rompimiento
de membranas y paredes celulares.
Primero
molimos un pedazo de hígado de pollo en un mortero, lo machacamos muy bien.
B. digestión.
Ya molido
bien el hígado se tomo muestras del mismo y se colocaron en pequeños tubos de eppendorf de 1 ml.
y se le agrego el buffer de extracción (tris-HCl 0.05 M, Urea 7 M) a temperatura de cuarto.
Una ves agregado el
buffer de agito bien la muestra y los que le hacían falta se agitaron de forma esporádica por 10 minutos.
C. A la
mezcla que teníamos le agregamos también después del buffer de extracción fenol
500ul usando guantes por la sustancia utilizada ya que es un poco peligrosa.
Después
se agito cuidadosamente en vortex dejándolo reposar por 5 minutos aproximadamente. Una vez agitado se paso a la extracción de la fase acuosa pero primero se centrifugo para poder separar bien las muestras y poder extraer el ADN del resto de las moléculas existentes.
D. Ya centrifugada
las muestras se extrajo en un nuevo tubo eppendorf limpio las diferentes
muestras del ADN que se obtuvieron o las
fases acuosas que quedaron por encima de los tubos.
y se le agrego 400 ul de
etanol 100% frio y 75
ul de NaCl 3 M,y se volvió a mezclar por inversión suavemente y se observo como quedo el ADN de la muestra utilizada, se volvió a centrifugar la muestra nueva por 2 minutos a 10000 revoluciones por minuto. Por ultimo se obtuvo algo como una pastilla que quedo en el fondo del tubo el cual es el ADN.
E. Resuspencion.
Por ultimo
el tubo con la pastilla se puso en 5 ml de agua destilada estéril, para poder
utilizarla en la próxima practica, ya que se va a purificar la muestra para que
quede limpia de cualquier residuo.RESULTADOS
Los resultados fueron los
siguientes:
asi fue como se vio el ADN que se pudo separar en forma de pastilla. este fue el resultado final de esta practica.
CONCLUSIONES
En
esta practica se logro el objetivo principal y planteado que es la extracción del
ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto siguiendo una serie de pasos
para poder lograrlo, así se pudo separar de otros componentes como proteínas, lípidos,
carbohidratos y se pudo distinguir cual era cual y el resultado final fue la extracción
y separación del ADN que se obtuvo en una forma de pastilla y se guardo para que
después se utilice pero primero se purifique para que no quede ningún resto de
residuos que no sean ADN. Esta práctica fue un éxito ya que se siguió paso a
paso como se debe de extraer y separar el ADN y por qué se hizo en presencia de
una persona capacitada y que fue verificando cada uno de los pasos y resultados
que se obtuvieron.
RECOMENDACIONES
Como
recomendaciones que uno haría seria que se siga investigando mas sobre otras formas de poder extraer el ADN y
poder separarlo, otras formas en que cualquier tipo de persona aunque con pocos
conocimientos sobre este tema lo pueda hacer por lo menos acompañado de otro
que sepa mas, siguiendo otros pasos y utilizando otras sustancias que fueran un
poco menos peligrosas y mas fáciles de obtener. Este trabajo queda como base
para otros que se animen a estudiar mas a fondo sobre como se va formando la
vida y los cambios que se van produciendo con el paso del tiempo y que puedan
utilizarla con tecnología de punta para que puedan realizarlo en menos tiempo y
con grandes resultados. Esta practica dejo otro gran trabajo que es la purificación
de la muestras de ADN, ya que se obtuvo
con residuos que no permiten estudiar bien el ADN. Los que se animen a seguir
estudiando esto deben de saber que no es tan difícil solo se necesita de
entusiasmo y dedicación con esto se puede lograr cualquier cosa que uno se
proponga y mas si esa cosa les llama mucho la atención.
CUESTIONARIO
1. PORQUE EL ADN EN SOLUCION SE PRECIPITA
EN PRESENCIA DE UN ALCOHOL FRIO?
Para que se pueda separar bien el
ADN de los demás componentes y así poder
obtener el puro ADN que nos interesa estudiar.
2. COMO SEPARAMOS DE NUESTRA MUESTRA EL ADN
DEL RNA?
Centrifugando las muestras varias veces
para poder obtener el ADN limpio.
3. CUAL ES LA FUNCION DEL CLOROFORMO?
Es el que nos va a permitir que se
puedan separar bien los diferentes componentes que se encuentran en la muestra
como, proteínas, lípidos, carbohidratos, y por supuesto el ADN.
4. COMO PODRIAS CUANTIFICAR LA CANTIDAD DE
ADN DE TU MUESTRA?
Primero separando bien el ADN de la muestra y después usando la técnica de
PCR( reacción en cadena de la polimerasa).
5. CUAL ES SU FUNCION Y LA IMPORTANCIA DEL
ADN EN LOS ORGANISMOS?
La
importancia principal del ADN es que en
el se guarda el material genético que es transmitido de generación en generación,
en el cual lleva todas las características de cada especie y que gracias a
estas características muchas especies u organismos han logrado sobrevivir y
adaptarse a diferentes medios. Una de sus funciones es que también se puede
duplicar así mismo el ADN y además de
tan solo un fragmento de ADN se puede amplificar para diferentes estudios o investigaciones tanto
criminales como médicas.
BIBLIOGRAFIAS
