9.2.1
FÍSICOS
MICROINYECCION
La micro inyección es
un proceso que consiste en utilizar micro agujas para insertar sustancias a un
nivel microscópico o en el límite de lo macroscópico dentro de una célula viva. Es un simple proceso mecánico en
el cual una aguja extremadamente fina penetra la membrana celular y a veces la membrana
nuclear para lanzar su
contenido. La micro inyección es normalmente realizada bajo un microscopio óptico llamado micro manipulador. El proceso
es frecuentemente usado como un vector en ingeniería genética y transgenética para insertar material genético en una
célula. El proceso de clonación también involucra micro inyecciones.
Las micro agujas
miden alrededor de 10 micrómetros. Pueden
contener cerca de 15 micro litros de ADN. Es similar a la
sección transversal de un cabello humano. Es un método muy preciso de
transferencia génica. Requiere personal capacitado.
Los
científicos pueden crear simples organismos transgénicos inyectando genes
dentro de los testículos de nematodos en el punto en que las células que se
convertirán en su esperma están bajo el proceso de meiosis.
La
micro inyección es usada como un vector en la producción de plantas
transgénicas.
La
micro inyección de genes dentro de óvulos fertilizados es un vector comúnmente
utilizado en la producción de animales transgénicos.
ELECTROPORACION:
La electroporación o electro permeabilización es
un significativo aumento de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causado por un campo
eléctrico aplicado
externamente. Es habitual en biología molecular como forma de introducción de
diferentes sustancias en células, como por ejemplo sondas
moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones
celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido.
Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática
excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la fuerza del
campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen
apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un
corto período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la
oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición excesiva de
células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o necrosis,
procesos que provocan la muerte celular.
En biología
molecular, el proceso de electroporación es usado habitualmente para la transformación de bacterias, levaduras y protoplastos vegetales.
Además de membranas lipídicas, las bacterias también tienen una pared celular compuestas de peptidoglicano
y sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por naturaleza y sólo
actúan como corazas que protegen a la célula de impactos ambientales severos.
Si bacterias y plásmidos se mezclan los plásmidos pueden
transferirse al interior de las células tras la electroporación. En este
proceso suelen emplearse varios cientos de voltios, que
atraviesan una distancia de varios milímetros.
A continuación, las células han de ser manipuladas cuidadosamente hasta que
tienen la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que
contendrán copias del plásmido. Este proceso es aproximadamente diez veces más
efectivo que la transformación por métodos químicos.
Este
procedimiento es también altamente eficiente para la introducción de genes externos en células en cultivo,
especialmente en las de mamífero.
Por ejemplo, se usa en el proceso de producción de ratones knockout, así como
en el tratamiento de tumores, terapia
génica y terapias
basadas en células. El proceso de introducir ácidos
nucleicos externos en células eucariotas se conoce comotransfección.
BIOBALISTICA:
El
término biobalística deriva de la conjunción de “biología y balística” o
“balística biológica”. Este es un método muy original ideado y refinado en la
década de 1980 por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell
(EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de célula.
En este procedimiento el ADN es introducido en las células por medio de
partículas microscópicas (macropartículas) aceleradas a velocidades
supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. Las partículas son
aproximadamente esféricas (de 0.4 a 2.0 micrómetros de diámetro), están hechas
de materiales densos como oro o tungsteno (ver microfotografía 1 y 2,
respectivamente), y se recubren con el ADN que se desea transferir a las
plantas. Para que las macropartículas pueda atravesar las membranas celulares y
llegar al núcleo de las células blanco, son impulsadas a gran velocidad por
explosión de pólvora seca, liberación de gas comprimido a alta presión (aire,
helio, CO2 o N2), o por una descarga eléctrica de una gota de agua. Una vez
dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de las macropartículas debido a
las modificaciones del entorno iónico.
Si
las partículas atraviesan las membranas y son atrapadas en el núcleo, el ADN
puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de
recombinación al azar, lo que se considera como transformación estable. La
transformación estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario
utilizar un sistema de selección in vitro (ver cuadernos Nº 5, 18 y 67) que
permita distinguir células transformadas y no transformadas.
En este método de transformación las construcciones genéticas son más simples e incluyen los genes de interés y de selección con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plásmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las células, o bien de forma de molécula lineal (el plásmido cortado en un punto), a diferencia de los plásmidos utilizados con Agrobacterium (plásmido ti desarmado). También es muy común que una vez obtenida la construcción genética dentro de un plásmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para sólo tener la secuencia con los genes de interés y de selección (incluidas las secuencias regulatorias) y así reducir el fragmento de ADN a transferir.
En este método de transformación las construcciones genéticas son más simples e incluyen los genes de interés y de selección con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plásmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las células, o bien de forma de molécula lineal (el plásmido cortado en un punto), a diferencia de los plásmidos utilizados con Agrobacterium (plásmido ti desarmado). También es muy común que una vez obtenida la construcción genética dentro de un plásmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para sólo tener la secuencia con los genes de interés y de selección (incluidas las secuencias regulatorias) y así reducir el fragmento de ADN a transferir.
9.2.2
QUÍMICOS
MÉTODO
DEL FOSFATO CÁLCICO.
Basado
en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una
solución salina de fosfatos. En esta
situación coprecipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por
las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la
degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado
es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales
como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.
MÉTODO
DEL DEAE DEXTRANO.
Basado
en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de
DEAE dextrano o polybreno tienen una
carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA.
El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico
mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las
transfecciones transigentes.
MÉTODO
DE LIPOSOMAS.
Se
basa en la formación de complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo
tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una
de las posibles vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada
flip-flap. Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección,
aunque existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a
partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar
las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias,
que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de
la placa. Las desventajas del método son, aparte del elevado precio de los
lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos
celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los
parámetros a optimizar son la relación entre lípido y DNA (relación de cargas),
la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se exponen las células al complejo y
la presencia o ausencia de suero.
BIBLIOGRAFIA
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