BIOLOGOCALENTANO: 9.1 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA NATURAL

9.1.1 TRANSFORMACIÓN.

La transformación es la transferencia genética que resulta de la incorporación de DNA desnudo por una célula receptora desde una célula donadora. Ciertas bacterias (ej. Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus) son capaces de tomar DNA del medio ambiente y ese DNA que es introducido puede llegar a ser incorporado al cromosoma de la célula bacteriana receptora.

Factores que afectan la transformación.

· Tamaño del DNA – Funciona mejor el DNA de doble cadena de al menos 5 X 10⁵ daltones. Por tanto, la transformación es sensible a las nucleasas del medio ambiente.

· Competencia de la célula receptora – Algunas bacterias son capaces de incorporar DNA en forma natural. Sin embargo, estas bacterias solo toman al DNA en una etapa particular de su ciclo celular, cuando producen una proteína específica llamada factor de competencia. Cuando la bacteria se encuentra en este estadio se dice que es competente. Otras bacterias no son capaces de incorporar el DNA naturalmente, sin embargo en estas bacterias la competencia puede ser inducida in vitro mediante tratamiento con sustancias químicas (ej. CaCl₂).

Pasos de la transformación.

· Incorporación del DNA – La incorporación del DNA por las bacterias Gram+ y Gram- es diferente. En las bacterias Gram+ el DNA se introduce en forma de moléculas de cadena sencilla y la cadena complementaria se sintetiza dentro de la célula receptora. En contraste, las bacterias Gram- incorporan DNA de doble cadena.

· Recombinación General/Legítima/Homóloga – Luego de que el DNA de la célula donadora se ha incorporado, ocurre un evento de recombinación recíproca entre el cromosoma y el DNA de la célula donadora. Esta recombinación requiere de que exista homología entre el DNA del donador y el cromosoma receptor, lo que finalmente resulta en la substitución de DNA entre la receptora y la donadora.

Esta recombinación requiere de los genes de la recombinación bacteriana (recA, B y C) y de que exista homología entre los DNAs involucrados. Este tipo de recombinación se denomina recombinación general, legítima u homóloga. Debido al requerimiento de homología entre las células donadora y huésped, solo el DNA de una bacteria cercanamente relacionada se esperaría que transformara exitosamente, aunque en raras ocasiones se ha demostrado que sí ocurre transferencia genética de este tipo entre bacterias relacionadas de forma más bien distante.

9.1.2 CONJUGACIÓN.

La conjugación es la transferencia de DNA de una donadora a una receptora, mediante contacto físico directo entre las células. En las bacterias existen dos tipos de células y son las donadoras (macho) y las receptoras (hembras) y la dirección de la transferencia genética es en un solo sentido; así el DNA se transfiere desde la donadora hacia la receptora.

Tipos de células acopladas (mating cells) en las bacterias

· Donadora – La capacidad de una bacteria de ser el donador es consecuencia de la presencia en dicha célula de una pieza extra de DNA, llamada factor F, factor de fertilidad o factor sexual. El factor F es una pieza circular de DNA que es capaz replicar en forma autónoma en la célula; es un replicón independiente. Las piezas de DNA extra-cromosomal que pueden replicar autónomamente, reciben el nombre genérico de plásmidos. El factor F posee los genes necesarios tanto para su replicación como para su habilidad de transferir DNA a la célula receptora. Una de las cosas que el factor F codifica es la capacidad de producir una estructura llamada pilus sexual (pilus F) sobre la superficie de la bacteria. Este pilus es importante en el proceso de conjugación. El factor F no es el único plásmido que puede mediar la conjugación pero generalmente se toma como modelo.

· Receptora – La capacidad de actuar como receptora es consecuencia de la carencia de esta célula del factor F.

Estados fisiológicos del factor F

· (F⁺) Autónomo – El factor F en este estado lleva solamente aquellos genes necesarios para su replicación y para la transferencia de DNA. No hay genes cromosomales asociados con el factor F en las cepas F⁺.

En los cruces del tipo F⁺ X F^- el F^- se convierte en F⁺ mientras que F⁺ permanece como F⁺. Por lo tanto, el factor F es infeccioso. Por otra parte, solamente se presenta un bajo nivel de transferencia de los genes cromosomales de la donadora.

· (Hfr) Integrado - En este estado el factor F se encuentra integrado en el cromosoma bacteriano, vía un evento de recombinación, como se ilustra en la Figura 5a

En los cruces del tipo Hfr X F^- el F^- raramente se convierte en Hfr y la célula Hfr permanece como tal. En éste caso existe una alta frecuencia de transferencia de los genes cromosomales del donador, de ahí que el nombre de la cepa sea hfr, del inglés high frequency of recombination.

· Autónomo con genes cromosomales (F') - En este estadio el factor F es autónomo, pero ahora contiene algunos genes cromosomales. Los factores F' se producen por escisión del factor F de una Hfr, como se ilustra en la Figura 5b. Ocasionalmente, cuando el factor F se escinde del cromosoma Hfr, los genes del donador localizados en cada lado del factor F pueden escindir junto con el factor F generando una F'. Los factores F' se denominan dependiendo de los genes cromosomales que contienen.

En los cruces del tipo F' X F^- el F^- se convierte a F' mientras que F' permance como tal. Por otra parte esta bacteria presenta una alta frecuencia de transferencia de aquellos genes cromosomales se encuentran en el F' y presenta una baja frecuencia de transferencia de otros genes cromosomales del donador.

Mecanismo de la conjugación.

Cruces F⁺ X F^-

· Formación del par - La punta del pilus sexual se pone en contacto con la receptora y formándose un puente de conjugación entre las dos células. Es a través de este puente que el DNA pasará del donador al receptor. De tal forma que el DNA queda protegido de las nucleasas ambientales. Los pares de acoplamiento o mating pairs pueden ser separados por fuerzas tan simples como la agitación y así la conjugación se puede interrumpir. Consecuentemente, los pares de apareamiento permanecen asociados solamente por un tiempo corto.

· Transferencia del DNA – El DNA del plásmido se corta en un sitio específico llamado origen de la transferencia y se replica mediante un mecanismo de círculo rodante. Una sola cadena de DNA pasa a través del puente de conjugación y entra a la receptora donde la segunda cadena se replica.

· Este proceso explica los cruces característicos F⁺ X F^-. La receptora se convierte en F⁺, la donadora permanece como F⁺ y presenta una baja frecuencia de transferencia de los genes cromosomales del donador.

Cruces Hfr X F^-

· Formación del Par

· Transferencia de DNA – El DNA sufre un corte en el sitio de origen de la transferencia y se replica mediante un mecanismo de círculo rodante. En este caso el DNA que se transfiere primero es el del cromosoma. Dependiendo del lugar del cromosoma donde el factor F se ha integrado y en qué orientación lo haga, diferentes genes cromosomales serán transferidos a tiempos diferentes. Sin embargo, el orden relativo y las distancias de los genes siempre permanecerán igual. Solo hasta que el cromosoma entero se haya transferido, entonces el factor F se transferirá. Ya que los movimientos tales como las fuerzas de agitación son capaces de separar a los pares sexuales formados, es raro que el cromosoma entero se transfiera. Por ello, la receptora generalmente no recibe el factor F en un cruce Hfr X F^-.

· Recombinación legítima – La recombinación entre el DNA transferido y el cromosoma da como resultado un intercambio del material genético entre la donadora y la receptora.

· Este mecanismo explica las características de los cruces Hfr X F^-. La receptora permanece como F-, la donadora permanece Hfr y existe una alta frecuencia de transferencia de los genes cromosomales a partir de la donadora.

Importancia – Entre las bacterias Gram negativas esta es la forma principal en que se transfieren los genes. La transferencia puede ocurrir entre diferentes especies bacterianas. La transferencia de resistencia múltiple a los antibióticos por conjugación ha llegado a ser un problema relevante en el tratamiento de ciertas enfermedades bacterianas. Debido a que la célula receptora se convierte en donadora después de la transferencia del plásmido, es fácil ver por qué un gen de resistencia a los antibióticos que va en un plásmido puede rápidamente convertir una población sensible de bacterias en una resistente. Las bacterias Gram positivas también tienen plásmidos que llevan genes de resistencia múltiple a los antibióticos, en algunos casos estos plásmidos se transfieren por conjugación mientras que en otras ellos se transfieren por transducción. El mecanismo de conjugación en las bacterias Gram + es diferente al de las Gram -. En las bacterias Gram + el donador produce un material adhesivo el cual causa agregación con el receptor y el DNA se transfiere.

9.1.3 TRANSDUCCIÓN.

La transducción es la transferencia de genes de una bacteria a otra por medio de un virus. La incorporación de genes bacterianos al interior de la cápsida de un fago se produce a consecuencia de errores cometidos durante el ciclo duplicativo del virus. Cuando el virus que contiene estos genes infecta a una nueva bacteria, éste tienen la capacidad de transferirlos al cromosoma de ésta. La transducción es el mecanismo más frecuente de intercambio y recombinación genética en las bacterias. Hay dos tipos diferentes de transducción: la generalizada y la especializada.

Transducción generalizada

Ocurre durante el ciclo lítico (ciclo donde el fago rompe la bacteria) de los fagos y es capaz de transferir cualquier parte del genoma bacteriano. Durante la fase de ensamblaje viral, fragmentos del cromosoma bacteriano pueden quedar en la cápsida viral. Cuando este fago infecta a una nueva bacteria, el material puede ser transferido al cromosoma bacterial. La cantidad de DNA bacteriano trasportado depende principalmente del tamaño de la cápsida del virus.

Transducción especializada

En la transducción especializada, la partícula viral modificada transporta porciones específicas del genoma bacteriano. Los genes transportados son Bio y Gal. Este proceso es posible debido a un error durante el ciclo liso génico. Esto ocurre cuando se induce a un fago a abandonar el cromosoma de la célula huésped observándose en ocasiones una escisión incorrecta. Esto hace que el fago se lleve uno de los 2 genes localizados en sus extremos (Bio y Gal). El genoma viral resultante contiene porciones del cromosoma bacteriano justo al lado del sitio de la integración.

9.1.5 TRANSFECCIÓN.

La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos(en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término transfección para métodos no virales se usa en referencia a células de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere para describir las transferencias no virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas. La transfección de células animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros" transitorios en la plasmática de las células mediante electroporación, para permitir el paso del material genético (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser transfectadas incluso proteínas (como anticuerpos, por ejemplo). Además de la electroporación, se pueden utilizar otras técnicas para efectuar la transfección, como por ejemplo liposomas producidos mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el material genético, que se fusionarán con la membrana plasmática celular y depositarán su carga adentro.

MÉTODOS

Hay varios métodos para introducir DNA en una célula eucariota. Se han usado muchos materiales como vehículos para la transfección, divisibles en tres tipos: polímeros (catiónicos), liposomas y nano partículas.

Uno de los métodos más baratos (y fiables) es la transfección mediante fosfato de calcio, originalmente descubierta por F. L. Graham y A. J. van der Eb en 1973.Una solución salina tamponada con HEPES y que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el DNA a transfectar. Cuando ambas se combinan, se forma un precipitado fino formado por el calcio cargado positivamente y el fosfato cargado negativamente, que el DNA en su superficie. Esta suspensión se añade a las células que se quieren transfectar (normalmente un cultivo celular en mono capa). Mediante un proceso no comprendido completamente, las células toman parte del precipitado, y junto con él, el DNA.

Otros métodos usan compuestos orgánicos altamente ramificados, los llamados dendrímeros, para unir el DNA e introducirlo en la célula. Un método muy eficiente es la inclusión del DNA en liposomas, pequeños cuerpos formados de una membrana en cierto modo similar a la membrana plasmática de la célula y que puede fusionarse con la misma, liberando el DNA al interior celular. Con células eucariotas, la transfección basada en la interacción lípido-catión es la más comúnmente utilizada, ya que son más sensibles a este método.

Otro método es el uso de polímeros catiónicos (o poli cationes) como DEAE-dextrano o polietilenimina. El DNA, cargado negativamente, se une al poli catión y el complejo es endocitado por la célula.

Una aproximación directa a la transfección es la balística o gene gun (pistola génica), en la que el DNA se une a una nano partícula compuesta de algún sólido inerte, generalmente oro, que es "disparada" directamente en el núcleo de la célula diana. El DNA puede también ser introducido en las células usando un virus como vector. En estos casos, la técnica es llamada transducción, y se dice que las células se transducen.