PRACTICA DE EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE ADN

SEP                          SNEST                        DGEST

"INSTITUTO TECNOLÓGICO

DE CIUDAD ALTAMIRANO”

PRACTICA: EXTRACCION Y SEPARACION DE ADN

PRESENTA: MARTIN HERRERA JUAREZ

No DE CONTROL: 09930312

CARRERA: LIC. EN BIOLOGIA

VI SEMESTRE

Ciudad Altamirano gro. México a 26 de marzo del 2012

RESUMEN

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como lava vajillas emulsionan  los lípidos de las membranas celulares y las rompen. La sal evita la unión de las proteínas al ADN. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

SUMMARY

DNA extraction requires a series of basic steps: First you have tobreak the cell wall and the plasma membrane to access the cell nucleus. Then you must also break the nuclear membrane to freeDNA. The soaps used as emulsifiers dishwasher lipids of cell membranes and break. The salt prevents the binding of proteins to DNA. To isolate the DNA needs to be done to precipitate in alcohol.DNA is soluble in water but when alcohol is unwound and precipitates in the interface between alcohol and water. In addition to allowing us to see the DNA, the alcohol separates the DNA from other cellular components, which are left in the aqueous solution.

INDICE

v  ANTECEDENTES_________________________________________1

v  DEFINICION DEL PROBLEMA_______________________________2

v  JUSTIFICACION___________________________________________3

v  OBJETIVOS_______________________________________________4

v  FUNDAMENTO TEORICO___________________________________5

v  MATERIALES Y METODOS__________________________________6

v  RESULTADOS____________________________________________7

v  CONCLUCIONES__________________________________________8

v  RECOMENDACIONES______________________________________9

v  FUENTES CONSULTADAS__________________________________10

ANTECEDENTES

La extracción y separación del ADN, no es muy conocido el método que se utiliza o la forma en como se extrae y se separa el ADN ya sea vegetal o animal para su estudio. Solo conocen la forma de hacerlo la gente que esta preparada como los químicos o biólogos, ya que estos tienen los conocimientos necesarios para poder hacerlo correctamente. La extracción y separación del ADN es importante ya que gracias a esto uno puede estudiar el ADN ya sea vegetal o animal para saber ciertas características que se desean conocer como por ejemplo; para conocer si una persona esta enferma o algo común que hacen los doctores antes de intervenir a un paciente en quirófano es hacerle un estudio de sangre para ver si anda bien en el numero de plaquetas y así poder determinar si lo interviene o no, entre otras cosas mas se puede  utilizar esta técnica.

Los motivos para la realización de este trabajo es que la gente que no esta preparada para hacer este tipo de estudios solo conozcan como  es el procedimiento y todo lo que implica realizarlo, además de que tengan conocimiento de cual es el principal objetivo de hacer estas técnicas, además de saber como uno puede separar diferentes moléculas como, proteínas, lípidos, carbohidratos y por supuesto ADN, para los estudios que se quieran hacer. Y si les interesa meterse mas a fondo sobre este tema puedan estudiar incluso una carrera que estudie todo lo relacionado con el ADN o con la vida como; la medicina o la biología, entre otras carreras similares.

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Se puede extraer ADN vegetal o animal?

Conque objetivo se extrae el ADN?

Cualquier persona puede realizar esta técnica?

El ADN tanto vegetal como animal se puede extraer y separar para un mejor estudio y las personas que hacen esto son personas altamente capacitadas, es decir, que tienen los suficientes conocimientos para llevarlo acabo correctamente. Ya que requiere de una serie de pasos y un laboratorio químico que tenga las suficientes sustancias que se requieren y los aparatos necesarios.

JUSTIFICACIÓN

Este presente trabajo tiene gran relevancia ya que es de gran interés para toda la sociedad en general, ya que a todos nos interesa saber mas sobre el estudio de la vida  ya que entre uno sepa mas sobre esto va a poder saber muchas cosas que antes no se sabían y mas si es para salvar su vida, todos sabemos que el ADN es donde se guarda todo el material genético que es trasmitido de una generación a otra y que esto ha permitido salvar a muchas especies y hacerlas mas fuertes. Y una forma mas fácil de poder estudiar el ADN es extrayéndolo y separándolo ya sea de tejidos animales o vegetales para  el estudio que se desee alcanzar, por esto y otras razones es importante este trabajo para conocer mas a fondo sobre como se puede extraer y separar el ADN y con que fines se hace, además este trabajo lo puede ver cualquier persona ya que no se necesita de dinero para poder obtener esta información solo de interés y entusiasmo por conocer mas sobre uno mismo.

OBJETIVO 

• Extraer DNA Y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

FUNDAMENTO TEÓRICO

El proceso de extracción del DNA geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas en la estructura de estos dos tipos de macromoléculas. 

El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.

El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y proteínas. 
La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interface. La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se aísla de las demás moléculas conforme sale de la solución. 
En la interface el RNA sale de la solución salina. 
En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa. 
Enseguida sale la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.
La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación. 
Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a sus cargas. 
Los fragmentos de DNA lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras. 
Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases. 
Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los fragmentos está la concentración de agarosa.

MATERIALES Y METODOS

Para realizar esta práctica se necesito de 2 horas en laboratorio para poder preparar el tejido que se iba a utilizar para poder extraer el ADN y poder separarlo. Además esta practica se izo en equipo para que fuera mas rápido mientras unos preparaban una cosa los otros empezaban con otras, por ejemplo unos machacaban bien el tejido a utilizar(hígado de pollo) y otros iban preparando la solución que se iba a utilizar una vez ya bien machacado el tejido, y así fuimos realizando toda la practica. Para realizar correctamente la práctica nos fue supervisando el profesor de biología molecular además de que nos íbamos guiando por un documento donde venían todos los pasos a seguir proporcionado por dicho profesor. Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes:

v  Tubos de centrifuga 1 ml

v  Tubos de ensayo de 5 ml

v  Centrifuga

v  Micropipetas de 1000 y 200ul

v  Agua destilada estéril (20ml para todos)

v  Etanol al 100 % frio (20ml es suficiente)

v  NaCL 3M

v  Buffer de extracción de ADN ( urea, NaCL, EDTA, 20ml es suficiente para todos)

v  Fenol frio (20ml es suficiente, manejase con guantes)

v  Mortero y pistilo

v  Hígado y sangre

v  Papel aluminio

v  Cleenpack

v  guantes 

El procedimiento fue el siguiente:

A.   Rompimiento de membranas y paredes celulares.

Primero molimos un pedazo de hígado de pollo en un mortero, lo machacamos muy bien.

B.   digestión.

Ya molido bien el hígado se tomo muestras del mismo y se colocaron en pequeños tubos de eppendorf de 1 ml.

 y se le agrego el buffer de extracción (tris-HCl 0.05 M, Urea 7 M) a temperatura de cuarto.

Una ves agregado el buffer de agito bien la muestra y los que le hacían falta se agitaron de forma esporádica  por 10 minutos.

C.   A la mezcla que teníamos le agregamos también después del buffer de extracción fenol 500ul usando guantes por la sustancia utilizada ya que es un poco peligrosa.

  Después se agito cuidadosamente en vortex dejándolo reposar por 5 minutos aproximadamente. Una vez agitado se paso a la extracción de la fase acuosa pero primero se centrifugo para poder separar bien las muestras y  poder extraer el ADN  del resto de las  moléculas existentes.

D.   Ya centrifugada las muestras se extrajo en un nuevo tubo eppendorf limpio las diferentes muestras del ADN  que se obtuvieron o las fases acuosas que quedaron por encima de los tubos.

y        se le agrego 400 ul de etanol 100% frio y 75 ul de NaCl 3 M,y se volvió a mezclar por inversión suavemente y se observo como quedo el ADN de la muestra utilizada, se volvió a centrifugar la muestra nueva por 2 minutos a  10000 revoluciones por minuto. Por ultimo se obtuvo algo como una pastilla que quedo en el fondo del tubo el cual es el ADN.

       

E.   Resuspencion.

Por ultimo el tubo con la pastilla se puso en 5 ml de agua destilada estéril, para poder utilizarla en la próxima practica, ya que se va a purificar la muestra para que quede limpia de cualquier residuo.

RESULTADOS

Los resultados fueron los siguientes:

para poder separar el ADN se centrifugo la muestra y así se pudo separar de los otros componentes, quedando por encima la sustancia acuosa que es el ADN.

asi fue como se vio el ADN  que se pudo separar en forma de pastilla. este fue el resultado final de esta practica.

CONCLUSIONES

En esta practica se logro el objetivo principal y planteado que es la extracción del ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto siguiendo una serie de pasos para poder lograrlo, así se pudo separar de otros componentes como proteínas, lípidos, carbohidratos y se pudo distinguir cual era cual y el resultado final fue la extracción y separación del ADN que se obtuvo en una forma de pastilla y se guardo para que después se utilice pero primero se purifique para que no quede ningún resto de residuos que no sean ADN. Esta práctica fue un éxito ya que se siguió paso a paso como se debe de extraer y separar el ADN y por qué se hizo en presencia de una persona capacitada y que fue verificando cada uno de los pasos y resultados que se obtuvieron.

RECOMENDACIONES

Como recomendaciones que uno haría seria que se siga investigando mas  sobre otras formas de poder extraer el ADN y poder separarlo, otras formas en que cualquier tipo de persona aunque con pocos conocimientos sobre este tema lo pueda hacer por lo menos acompañado de otro que sepa mas, siguiendo otros pasos y utilizando otras sustancias que fueran un poco menos peligrosas y mas fáciles de obtener. Este trabajo queda como base para otros que se animen a estudiar mas a fondo sobre como se va formando la vida y los cambios que se van produciendo con el paso del tiempo y que puedan utilizarla con tecnología de punta para que puedan realizarlo en menos tiempo y con grandes resultados. Esta practica dejo otro gran trabajo que es la purificación de la  muestras de ADN, ya que se obtuvo con residuos que no permiten estudiar bien el ADN. Los que se animen a seguir estudiando esto deben de saber que no es tan difícil solo se necesita de entusiasmo y dedicación con esto se puede lograr cualquier cosa que uno se proponga y mas si esa cosa les llama mucho la atención.

CUESTIONARIO

1.    PORQUE EL ADN EN SOLUCION SE PRECIPITA EN PRESENCIA DE UN ALCOHOL FRIO?

Para que se pueda separar bien el ADN  de los demás componentes y así poder obtener el puro ADN que nos interesa estudiar.

2.    COMO SEPARAMOS DE NUESTRA MUESTRA EL ADN DEL RNA?

Centrifugando las muestras varias veces para poder obtener el ADN limpio.

3.    CUAL ES LA FUNCION DEL CLOROFORMO?

Es el que nos va a permitir que se puedan separar bien los diferentes componentes que se encuentran en la muestra como, proteínas, lípidos, carbohidratos, y por supuesto el ADN.

4.    COMO PODRIAS CUANTIFICAR LA CANTIDAD DE ADN DE TU MUESTRA?

Primero separando bien el ADN  de la muestra y después usando la técnica de PCR( reacción en cadena de la polimerasa).

5.    CUAL ES SU FUNCION Y LA IMPORTANCIA DEL ADN EN LOS ORGANISMOS?

La importancia principal del ADN  es que en el se guarda el material genético que es transmitido de generación en generación, en el cual lleva todas las características de cada especie y que gracias a estas características muchas especies u organismos han logrado sobrevivir y adaptarse a diferentes medios. Una de sus funciones es que también se puede duplicar así mismo el ADN  y además de tan solo un fragmento de ADN se puede amplificar para  diferentes estudios o investigaciones tanto criminales como médicas.

BIBLIOGRAFIAS

vhttp://www.educa.madrid.org/web/ies.antoniogala.mostoles/dep_bio_archivos/EXTRACCION_DE_ADN.pdf.

v  http://www.forosperu.net/showthread.php?t=119144&page=3